Cómo calibrar columnas de gel de filtración

columnas de filtración en gel se utilizan para las proteínas separadas a partir de mezclas complejas . Puesto que cada proteína tiene un peso molecular único, pueden ser inducidas a separarse en distintas capas mediante la migración a través de una columna de filtración que contiene una matriz de gel uniformemente distribuida. Para identificar correctamente cada proteína que se separa, se tendrá que calibrar las columnas usando varias proteínas de weight.Things moleculares conocidas que necesitará
carbónico anhidrasa
citocromo C
aprotinina
sal basal
tubos centrífuga
ferritina
Centrífuga
Pipet bomba
250 ml cilindro graduado
Buffer líquido
limpieza Científico toallitas
jeringa barril
Mostrar Más instrucciones
1

Retire los viales de la anhidrasa carbónica , el citocromo C y aprotinina de la nevera o en el congelador y deje que alcancen la temperatura ambiente . Añadir 4 mg de cada proteína a un tubo de centrífuga por mililitro de gel en la columna de la filtración. Añadir 961 mcl de sal basal por miligramo de proteína a cada tubo de centrífuga para disolver las proteínas . Añadir 39,2 mcl de ferritina por mililitro de gel a cada tubo y luego se mezcla en una centrífuga .
2

Apague la bomba de la columna de filtración y cerrar la llave de paso en la entrada de la columna . Afloje , pero no quite , la parte superior de la columna de filtración . Establecer la bomba a la velocidad de flujo máxima para la columna y reinicie la bomba hasta que el material se ha elaborado tampón apagado. Parar la bomba .
3

Añadir 1 ml de cada proteína a la columna de filtración utilizando una bomba de pipeta. Gotear las proteínas por el interior de la columna desde una altura de 1 cm a 2 cm , trabajando alrededor del borde interior de la columna . Deje que la mezcla de proteínas se asiente en la parte superior de la matriz de gel .
4

Coloque el tubo de salida de la bomba en un lugar limpio , seco 250 ml cilindro graduado . Reiniciar la bomba a una velocidad de 0,30 ml por minuto y ejecutar las proteínas en la matriz de gel . Mientras que la bomba está funcionando , enjuagar los lados del tubo usando la bomba de pipeta y una pequeña cantidad de líquido tampón . Una vez que las proteínas han entrado completamente en la matriz de gel , reducir la velocidad de la bomba a 0,02 ml por minuto y la bomba en una capa de 5 cm a 7 cm de líquido tampón en la parte superior de la matriz.
5

Desconectar el tapa de la columna de la llave de paso. Limpiar la tapa de la columna y el interior de la columna usando toallitas de limpieza científicos. Vuelva a instalar la tapa de la columna . Llene el depósito de acumulación de líquido tampón . Conecte un tubo de la jeringa a la llave de paso y abrirlo. Utilice la jeringa para extraer una pequeña cantidad de tampón a través del tubo y en la jeringa. Cierre la llave de paso y vuelva a colocarlo en la parte superior de la columna. Abra la llave de paso y verifique que no haya fugas .
6

Ejecutar la columna a 0,02 ml por minuto durante varios días , hasta que la banda de ferritina se acerca al final de la columna. Recoger toda la filtración en gel que se bombea en el cilindro graduado .