Secado Métodos Protocolo de PVDF

Al enlazar los ácidos nucleicos o proteínas , un material de alta vinculante llamado PVDF ( difluoruro de polivinilo ) membrana proporciona soporte para los anticuerpos . A través de la transferencia Western , las membranas se apilan juntas , preparado para el anticuerpo y luego se seca. Protocolo para el secado de la membrana requiere el conocimiento de cómo funcionan las membranas , placas de cátodo , placas de ánodo y la aplicación de soluciones de metanol . Con el protocolo correcto , la membrana se une de manera segura con el anticuerpo específico y está listo para su uso o almacenamiento inmediato . Preparación de la membrana

Preparación de la membrana de PVDF limpia y estabiliza la membrana antes de la transferencia . Antes del secado , la membrana es & quot ; bloqueada & quot ; para evitar la unión de otro que los ácidos nucleicos específicos , tales como anticuerpos no específicos nada. Durante este procedimiento , usted se orinó en la membrana colocándola sobre una superficie plana cubierta en metanol . La membrana cambia de color durante esta frase , de opaco a semitransparente. Una vez terminado con el baño de metanol , se coloca la membrana en agua desionizada en remojo durante aproximadamente dos minutos. La membrana debe absorber a continuación, de nuevo en una solución de metanol que es altamente ácida.
Asamblea de las membranas antes de la transferencia

Dos de los papeles de membrana se sumergen en la primera solución de metanol y se coloca en una placa de ánodo. Durante este proceso , usted debe comprobar cuidadosamente si hay burbujas de aire atrapadas , lo que podría poner en peligro la transferencia. Otra pieza de papel de filtro se empapa en la segunda solución de metanol y se coloca en la parte superior de la pila. Un gel luego se va en la parte superior de la membrana, con cuidado de no atrapar burbujas de aire entre la aplicación del gel y la membrana . Tres nuevos trozos de papel se sumerge entonces en un tampón de cátodo y se colocan en la parte superior del gel. Si se produce cualquier burbujeo de aire , un tubo de ensayo trabaja para suavizar las membranas .
Transferencia

En esta parte del proceso , se conecta de alta tensión cables a una fuente de alimentación y aplicar una corriente constante a la zona de gel sobre la membrana durante 30 minutos. Los tiempos de transferencia variarán dependiendo del tipo de anticuerpo . Después de 30 minutos , se quita la fuente de alimentación y la membrana de transferencia . La esquina inferior derecha de la membrana se corta a continuación para comprobar la orientación. Las dos primeras capas de papel de filtro se descartan , incluyendo el gel. Las bandas de peso molecular están marcados con un bolígrafo .
Secado

Una vez finalizada la transferencia , usted seca la membrana en una de dos maneras . Para un secado más rápido , la membrana se sumerge en 100 por ciento de metanol durante 10 segundos para eliminar el agua . La membrana descansa entonces sobre un trozo de toalla de papel durante 15 minutos. Para un método de secado más lento, la membrana se coloca sobre la toalla de papel sin añadir metanol. Una vez seca , la membrana puede ser utilizada o almacenada en un recipiente seco a 4 grados centígrados para su uso futuro .