Cómo utilizar Sanger Reactivos

reactivo de Sanger se utiliza para ayudar a determinar la secuencia de aminoácidos que forman un péptido . El reactivo se enganchará en - o etiqueta - el aminoácido en el extremo de una cadena de péptidos, también conocido como el N -terminal. El péptido se puede romper en trozos ( hidrolizados ) y los aminoácidos individuales examinadas usando diversos métodos de cromatografía . Sea cual sea el amino ácido lleva la etiqueta es la que al final. El reactivo de Sanger también se conoce como dinitrofluorobenceno ( DNFB ) . Una vez que se ha aferrado a un aminoácido , que se conoce como DNP- compound.Things que necesitará escala laboratorio
Guantes
Gafas de seguridad
centrífuga
Tubos centrífuga
pipetas Pasteur
agua destilada
solución 4.2 % de bicarbonato de sodio
Reactivo ( FDNB )
papel de Sanger pH
éter dietílico
disolución 6 M de ácido clorhídrico
Acetona
Prueba tubo de
Mostrar Más instrucciones Matemáticas 1

Pesar 3 miligramos de péptido en una escala . Colóquelo en un tubo de centrífuga . Añadir aproximadamente 0,3 ml de agua, 0,3 ml de reactivo de Sanger y 0,075 ml de bicarbonato de sodio .
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Permitir que el tubo de centrífuga de incubar a temperatura ambiente durante una hora . Durante la incubación , agitar el tubo suavemente para evitar que la mezcla se separe . Comprobar el pH de la solución cada 15 minutos con papel de pH . El pH debe mantenerse por encima 9. Si comienza a caer , añadir una pequeña cantidad de bicarbonato de sodio ( aproximadamente una gota con la pipeta Pasteur ) .
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Después de la incubación, añadir 1,5 ml de agua y una cantidad igual de éter . Deje que la solución se separa en capas . Puede que tenga que centrifugar la mezcla para separarla . Retire la capa de éter ( la parte superior , capa amarilla ) con una pipeta y descártelo.
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Ajustar el pH a 1,0 por adición lenta de ácido clorhídrico. Añadir un poco de ácido a la vez , revuelva suavemente , a continuación, comprobar el pH con papel pH . En total , se debe requerir alrededor de 0,15 ml de ácido . Si el pH está por debajo de 1.0 , agregue una pequeña cantidad ( no más de una gota ) de bicarbonato de sodio .
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Añadir 3 ml de éter . Deje que la mezcla se separe . Ahora la capa superior ( la capa amarilla , éter ) contiene su DNP- compuesto . Con una pipeta , extraer con cuidado esta capa y la transfiere a un tubo de ensayo limpio . Coloque el tubo de ensayo a un lado y deje que el líquido se evapore , dejando tras de sí un sólido amarillo .
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seco Lave su sólido con acetona . Añadir 0,3 mililitros de acetona , revuelva suavemente y extraer el líquido con una pipeta. Añadir 0,75 mililitros de ácido al tubo de ensayo . Su péptido está marcado y listo para ser hidrolizado y analizó con el método de cromatografía de su elección .