Cómo preparar una gota colgante

Para determinar la estructura 3D de una proteína , primero necesita un cristal puro de ella . El método de la gota pendiente utiliza una gota de solución que contiene proteínas que cuelga de un cubreobjetos . Debajo de esta gota colgante se encuentra un depósito con una concentración de sal mayor que la de la gota. Con el tiempo , el vapor de agua sale de la gota y termina en el depósito , haciendo que la proteína a cristalizar. Cada proteína requiere diferentes condiciones ( tales como la concentración de sal y pH ) , y con frecuencia de ensayo y error ofrece la única manera de encontrar los conditions.Things derecha que necesitará Escudo de laboratorio , guantes y protección para los ojos
Micropipeta con pipeta consejos
1 solución molar de cloruro de sodio en tampón de acetato 0,05 molar , pH 4,7
2 tubos Eppendorf ml (o similar)
Centrifugar
de 24 pocillos grasa de vacío placa
en jeringa
siliconados cubreobjetos
aire comprimido
pinzas
Clay (por ejemplo, plastilina o similar) radio de 50 mg /ml de lisozima en 0,05 solución tampón de acetato molar , pH 4,7
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Matemáticas 1

Ponga en el engranaje de laboratorio ( abrigo , guantes y protección para los ojos ) .
2

Utilizar una micropipeta para agregar 1,1 ml de cloruro de sodio (sal ) y una solución tampón de acetato en un tubo Eppendorf .
3

Centrifugar el tubo cerrado Eppendorf con la solución de sal en su interior durante unos cinco minutos a 13.000 rpm . Recuerde para equilibrar la centrífuga mediante la colocación de otro tubo Eppendorf que contenía 1,1 ml de agua a través de y opuesta al tubo de solución salina.
4

Añadir 1 ml de la solución de sal a un pozo en una de 24 pocillos placa .
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Utilice una jeringa lleno de grasa para colocar una capa fina de grasa alrededor del borde de este pozo . Tenga cuidado de no agregar demasiado poco o demasiado . Si se añade demasiada grasa, la grasa se ​​ejecutará en el pozo y posiblemente arruinar su experimento. Si usa muy poco, el pozo no será hermético y su experimento no funcionará . Trate de que solo la grasa suficiente que el cubreobjetos y la grasa forman un sello hermético en el futuro.
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Rollo de la arcilla con sus manos para hacer cuatro bolas pequeñas , y empujarlos a las cuatro esquinas de la 24 así placa . Ellos actuarán como soportes para asegurar la cubierta de la placa no entre en contacto con el cubreobjetos .
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Utilice aire comprimido para soplar el polvo fuera del cubreobjetos . Sostenga el cubreobjetos con unas pinzas limpias .
8

Aspirar 4 microlitros de la solución de lisozima con su micropipeta , y agregar esta solución al centro del cubreobjetos . Cambie las puntas de pipeta , y añadir 4 microlitros de la solución de sal . Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo , chupando en el líquido y luego expulsarlo , para mezclar la solución salina con la solución de lisozima. Tenga cuidado al mezclar los dos sin dispersar el líquido en todo el cubreobjetos .
9

Gire el cubreobjetos sobre rápidamente para que el líquido no se deslice , y la planta de lleno en lo alto del pozo. Tenga cuidado de presionar suavemente sobre el mismo por lo que forma un sello hermético con la grasa alrededor de los bordes del pozo .
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Presione la tapa de la placa de 24 pocillos sobre las bolas de arcilla , y dejar la placa en un lugar fresco .